技術情報・その他動物毛のDNA検査プロトコル


技術情報・その他

動物毛のDNA検査プロトコル

動物毛(異物)判定における注意点

 DNA検査を行うにあたっては、試料異物の混入していた原材料の状況を熟慮してください。
 また、可能な限り顕微鏡観察を行い、最終判定は出来る限り慎重に行ってください。

動物毛のDNA検査プロトコル

次の4つのステップがあります。

  1. 動物毛の洗浄・採取                        0.5時間
  2. DNAの抽出                                   1.5時間
  3. PCR                                        1.5時間
  4. アガロースゲル電気泳動          1.0時間

1 動物毛の洗浄・採取

 70%エタノールで付着物を除き、カミソリでカットしてマイクロチューブに採取します。

2 DNAの抽出

 DNA抽出試薬 QIAamp DNA Micro Kit(50)を用いて約15マイクロリットルのDNA溶液を調製します。(詳細は下記マニュアル参照↓)

 https://www.qiagen.com/jp/resources/resourcedetail?id=db457676-7cd4-4f24-8f06-fbcccf0b4797&lang=ja-JP

3 PCR

 PCR用酵素 QIAGEN Fast Cycling PCR Kit(100)と動物DNA検出プライマーを用いてPCRを行います。

 (PCR酵素:https://www.qiagen.com/jp/resources/resourcedetail?id=0c546b1f-04ad-4f3d-83fe-d46a09d74e7f&lang=ja-JP

〈反応組成:1動物ごとの検出の場合〉
PCR Master Mix                      10 μl
10×Coralload Dye                    2 μl
動物プライマー(10μM each)       1 μl
調製したDNA溶液                      2 μl(適宜変更可)
RNase free H2O                       5 μl(適宜変更可)
Total                                     20 μl
※陽性対照は動物DNA、陰性対照は添付滅菌水を使用

〈反応条件〉
95℃,  5min →【96℃,  5sec → 60℃,  5sec → 68℃,  9sec】 → 72℃,  1min
  【  】45サイクル(~50まで適宜)

 動物の種類が推定できない場合は、

 プライマーセットA(牛プライマー1μl+豚プライマー1μl+鶏プライマー1μl=3μl)
 プライマーセットB(馬プライマー1μl+羊プライマー1μl+山羊プライマー1μl=3μl)
 プライマーセットC(兎プライマー1.25μl+犬プライマー1.25μl+猫プライマー0.5μl=3μl)
 プライマーセットD(ドブネズミプライマー1μl+クマネズミプライマー1μl+ハツカネズミプライマー1μl=3μl)

   で4反応を行い、バンドが検出された動物についてシングルPCRで確認試験を行います。

4 アガロースゲル電気泳動

 4% Agarose/TAE(シングルPCRでは2%程度で可)を事前に作製しておきます。サイズマーカーとPCR反応物5μlをアプライし、100Vで約50分間泳動します。通常のエチジウムブロマイド染色をし、UV撮影を行います。

詳細プロトコル

動物毛のDNA 検査プロトコル詳細版(PDF)(2008.8.21 愛知県産業技術研究所(現あいち産業科学技術総合センター)食品工業技術センター 作成)

問合せ

あいち産業科学技術総合センター
食品工業技術センター(発酵バイオ技術室)
電話 052‐325‐8092
FAX 052‐532‐5791

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